随着全球气候的持续变化和人口的不断增长，土地盐碱化成为了全球非常严重的环境问题和制约粮食增产的重要因素之一。世界上的盐碱地面积共有9.543 8×109 hm2，其中我国就有9.913×10⁸ hm² (曾长立和陈禅友, 2010)，并且现在工业污染不断严重、不合理灌溉及过量施用化肥等，使得次生盐碱化土地的面积还在扩大，给农业生产造成了重大的损失，且有加剧之势。玉米(Zea mays L.)是世界上三大重要粮食作物之一和首选的饲料作物，在世界农业生产上有不可替代的地位，但玉米对盐碱中度敏感，耐盐性相对来说较差，这极大限制了玉米在盐碱滩地上的种植。近年来，随着生物技术的迅速发展，采用植物基因工程技术培育抗逆转基因玉米已经成为在盐碱地上种植玉米的非常有效的途径之一(Yamaguchi and Blumwald, 2005)。目前，用于转基因玉米的遗传转化技术包括PEG介导(Golovkein et al., 1993)、电穿孔法(Kathleen et al., 1992)、碳化硅晶须介导(Frame et al., 1994; Petolino et al., 2000)、基因枪(Gordon-Kamm et al., 1990; Wan et al., 1995)、农杆菌介导(Ishida et al., 1996; Negrotto et al., 2000; Zhao et al., 2001; Frame et al., 2002)和超声波处理花粉介导植物基因转化方法(孙毅等, 2006)等。在这些方法中，超声波处理花粉介导植物基因转化法起步较晚，但其因操作简单、不需贵重仪器以及转化率高等优点，使用范围和规模日益扩大，在玉米、花生、油菜、谷子等作物上均有成功转化的案例。宋鉴达等(2012)采用超声波处理花粉转化法获得玉米转基因新材料；杜建中等(2011)利用花粉介导法将抗MDMV病毒的水稻NibT基因转入玉米中；魏玉杰等(2010)也用此方法将萝卜抗菌肽基因导入野罂粟。但迄今尚未见到利用花粉介导法获得抗旱耐盐玉米植株及提高其抗逆性的报道。

甜菜碱(betaine)是生物界广泛存在的细胞相容性物质，也是公认的在微生物和植物细胞中起着无毒渗透保护剂作用的主要次生代谢积累物之一，其积累使许多代谢过程中的重要酶类在渗透胁迫下能继续保持活性。现已证明，在高等植物中，甜菜碱是由胆碱在胆碱单氧化物酶(CMO)催化下生成甜菜碱醛，再由甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化最终合成甜菜碱。其中由CMO催化的第一步氧化反应是限速步骤，BADH催化的第二步是氧化反应。甜菜碱是一种非常有效的无毒渗透调节剂，它的相关代谢途径已经成为抗逆基因工程中的研究重点。沈义国等(2001)通过从山菠菜中克隆了CMO基因，将其转入烟草中获得了耐盐转基因烟草植株。本研究将抗旱耐盐基因山菠菜胆碱单加氧酶(AhCMO)基因利用花粉介导法转化玉米，并对其T3代自交株系进行耐盐性处理，其后通过苗情观察及生理生化指标的测定分析转基因后代的耐盐性鉴定，从而确定其耐盐程度，以期获得抗逆性玉米株系，为下一步培育抗逆玉米品种奠定基础及提供一定的种质资源。

1结果与分析
1.1 T₃代玉米植株的获得及PCR扩增检测结果
2011年经花粉介导法转化玉米300株，收获T₀种子276粒，T₀种子经卡那筛选及PCR检测，阳性结果植株有37株，来年播种这37个株系得到T₂代植株，PCR检测结果表明阳性结果率达46%~55%，将这些植株自交授粉得到T₂种子。

选取5份T₂代转基因玉米种子株系，每个株系的70粒T₂代种子盆栽出苗得T₃代植株，经PCR检测，N48株系有阳性植株55株，N36株系有阳性植株45株，N12株系有阳性植株54株，N31株系有阳性植株48株，N32株系有阳性植株50株。从这些阳性植株中挑选生长一致的植株各18株，每个处理6株，三次重复，进行盐胁迫试验和测定生理生化指标。

部分T₃代转基因植株的PCR检测结果如图1所示，可以观察到目的基因(CMO)的特异性扩增条带大小与阳性对照质粒DNA的扩增产物片段大小一致，而试验所设阴性对照植株DNA未出现特异扩增条带。

图1 部分T3代转基因植株电泳检测结果 Figure 1 Partial PCR detection result of putative T3 transgenic plants

1.2筛选NaCl鉴定浓度
在不同NaCl浓度处理下，观察非转基因‘郑58’幼苗的形态表现，当盐溶液浓度小于150 mmol/L时，所有植株都未表现出明显受害症状；而盐溶液浓度大于300 mmol/L时，参试幼苗干枯严重致死；当NaCl溶液浓度在150~300 mmol/L之间时，各个处理间表现出了一定的耐盐性差异并且有部分致死。根据幼苗对NaCl溶液的反应以及幼苗自身的生长状况(表1; 图2)，本试验确定的玉米苗期耐盐性处理的适宜浓度为250 mmol/L NaCl溶液。在此浓度下玉米幼苗生长近于停止，且大部分幼苗开始枯萎甚至死亡。

表1 玉米幼苗在不同盐浓度处理下的生长状态 Table 1 The growth status of maize seedlings under various salt stress

图2 不同浓度NaCl盐胁迫一周后玉米幼苗生长状况 Figure 2 The growth status of maize seedlings under various salt stress for a week

1.3 NaCl胁迫对转基因玉米幼苗SOD、POD活性和MDA、叶绿素含量的影响
在用250 mmol/L NaCl溶液处理玉米幼苗一周后，非转基因玉米的SOD酶活性为128.62 U/g鲜重；各转基因玉米株系的SOD酶活性在131.14~396.76 U/g鲜重之间，比对照高出2%~208% (表2)。

POD能分解植物体内过多的过氧化物，是植物体内的一种保护酶。用250 mmol/L NaCl溶液处理后，非转基因玉米的POD酶活性为1 206.50 U/g鲜重；其中4份转基因玉米的POD酶活性在1 470.50~1 988.33 U/g鲜重范围内，比非转基因玉米酶活性提高了22%~65%(表2)。但株系N36的POD酶活性比对照低，出现这种现象可能是由于非转基因植物与各转基因株系之间自身的耐盐性差异造成的。

叶绿素是植物体内光合作用的场所，它在盐胁迫下合成受阻，从而抑制代谢过程，对植物生长造成严重伤害。在本试验中，在盐胁迫下，参试的5份转基因后代株系的叶绿素含量均高于非转基因对照8%~61% (表2)，且其中4份与对照差异显著。

表2 盐胁迫对转基因玉米植株SOD, POD酶活性和叶绿素, MDA的影响 Table 2 Effects of NaCl stress on SOD, POD activities, and chlorophyll, MDA contents in the transgenic maize plants

丙二醛(MDA)是植物膜脂过氧化所产生的，积累愈多说明植物组织的保护能力愈差，细胞膜被破坏的愈严重。本研究表明，在盐胁迫下，转基因玉米MDA的含量均低于非转基因对照(表2)，其原因可能是由于CMO基因的大量表达提高了转基因植株在盐胁迫下膜脂的抗氧化能力。

1.4转基因玉米耐盐性级别评价
本研究依据转基因后代株系的平均值与非转基因植株平均值(表3)的差值，对转基因玉米的耐盐性强弱进行了分级。分级标准(单长建等, 2012)为：差值x≤0.5，转基因玉米比对照耐盐性提高0级，耐盐性无提高；差值0.5<x≤1.2，转基因玉米株系的耐盐性比对照提高1级，耐盐性稍有提高；差值1.2<x≤1.9，转基因玉米耐盐性提高2级，耐盐性显著提高；差值x>1.9，转基因玉米比非转基因对照耐盐性提高3级，耐盐性大幅度提高。

依据上述分级标准，本试验的5份供试转基因后代株系中，株系N36耐盐性无提高，为0级；株系N31和N32耐盐性提高2级；株系N48和N12耐盐性提高3级。最终筛选到高耐盐株系N48和N12。

表3 依据生理生化指标对转CMO基因后代耐盐性的评价结果 Table 3 Evaluation of salt tolerance according to physiology and biochemistry indices in transgenic maize lines with CMO gene

2讨论
转基因植株由于其在遗传时能否保持外源基因的稳定性及在表达时出现转录水平的基因沉默等现象导致其遗传不稳定。杜建中等(2011)研究了采用花粉介导法获得的转基因后代株系，研究表明导入的目的基因能在各世代间稳定遗传，世代间转基因株系的抗病性水平相近，且T₃代后能够得到纯合的转基因株系。王守才等(1999)认为转基因T₀-T₂代表现都相对不稳定，但经自交和选择，大部分株系在T₃代以后都能正常表达转入的基因，并在群体中稳定遗传。因此本研究选用转基因T₃代玉米植株进行耐盐性鉴定大大减轻了选择遗传稳定的转化体系所需的大量工作。

在植物中，甜菜碱是由CMO和BADH分两步催化合成的。BADH基因工程研究相对较多，但CMO基因工程方面的研究报道相对较少。Nuccio等(1998)将菠菜CMO基因导入烟草中进行表达，虽然CMO蛋白正常分布在叶绿体中，但酶活力很低，无论是在盐胁迫或非胁迫下转基因烟草中只含有很少量的甜菜碱，他们认为是低含量的内源胆碱使甜菜碱的合成受到限制。但沈义国等(2001)将CMO基因转入烟草中获得了耐盐转基因烟草植株，他们认为单独转化CMO基因获得的转基因植株可以合成甜菜碱。本文对5份转基因玉米材料的耐盐性研究表明转CMO基因能够提高玉米的耐盐性，并且也进一步证实了单独转CMO基因是有效的。本实验选用的5份转基因株系，其中4份的耐盐性提高了2~3级，这也证实了花粉介导法有一定的成功转化率。研究获得的高耐盐株系是自交T₃代，接近纯合株系，可为下一步玉米抗逆育种的研究提供种质资源。

虽然本研究单独将CMO基因转入玉米中提高了其耐盐性，但Rhodes和Hanson (1993)及McNeil等(1999)的研究发现尽管在目前已成功转化BADH基因的转基因植株体内均测定到有积累的甜菜碱，并能在植株受到胁迫时起到保护作用，但相对盐生植物来说，转基因植株体内的甜菜碱含量要低得多，耐盐性也远比盐生植物差。Kishitani等(2000)认为给转BADH基因水稻补充外源甜菜碱醛后其细胞内的甜菜碱含量会迅速增加。由此可见，如果将合成甜菜碱过程中所需的CMO基因和BADH基因同时转入植物中，转基因植物的耐盐性会更强。

3材料与方法
3.1试验材料与质粒
试验受体材料为玉米自交系‘郑58’，由山西省农科院作物遗传育种研究所提供。供体为含有CMO基因的质粒表达载体pBin438 (图3)，由中国科学院遗传与发育研究所陈受宜老师惠赠。质粒中包含1个选择标记基因NPTⅡ，该基因赋予植物对卡那霉素的抗性，为植物筛选标记。目的基因CMO受35S启动子和NOS终止子调控。质粒寄主为大肠杆菌菌株DH5α。

图3 pBIN438-AhCMO Figure 3 pBIN438-AhCMO

3.2转基因植株获得的方法
依据王景雪等(2001)的方法提取质粒DNA及转化玉米。将处理花粉授粉到已剪掉部分花丝的玉米花丝上，对转化植株套袋，防止异株花粉污染。秋季收获T₀代种子，将T₀代种子在芽期进行卡那霉素抗性筛选，将筛选后存活下来的疑似转化株(即T₁代植株)移栽到大田中，于4~5片叶时取样进行DNA提取和PCR检测(具体方法见3.3.1和3.3.2)，将检测结果为阳性的植株严格自交授粉，秋季收获T₁代种子。来年播种T₁代种子，以同样的方法检测筛选得到T₂代植株，将PCR检测结果为阳性的植株自交授粉收获T₂代种子。

3.3转化植株DNA提取和PCR分子检测
3.3.1植物DNA提取
取各代植株在4~5叶期约200 mg幼嫩叶片样品，提取植物总DNA (王关林和方宏筠, 2005, 科学出版社, pp.742-744)。

3.3.2 PCR检测
以Primer 1：5'-gcaacaacaatgttgctaa-3'；Primer 2：5'-aaccagcagtggaaatggt-3'为引物(上海生工合成)，提取的转基因植株DNA为模板，非转化郑58植株的DNA为阴性对照。PCR程序采用94℃预变性5 min，94℃变性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸105 s，32个循环后，于72℃终延伸10 min。将扩增产物于1%琼脂糖凝胶上电泳分离，在SYN凝胶成像系统上观察照相。扩增产物片段长度为1 286 bp。

3.4转基因后代的耐盐性检测
3.4.1 NaCl鉴定浓度的确定
选取健康、大小、饱满度一致的郑58非转基因玉米种子，用10 g/L次氯酸钠溶液消毒20 min，清水洗净后于室温下清水浸种6 h。然后将其置于铺有两层滤纸的培养皿中，于培养箱中发芽，其间及时补充清水。萌发后(芽长3~5 mm)，挑选芽期生长状况良好、长势一致的种子播种到装有等量蛭石的塑料盆内，同时各盆浇灌等量的1/2 Hoagland营养液，播完后在温室中培养。等到长出第二片真叶时，进行间苗，每盆保留6株长势一致的健康幼苗。待幼苗三叶一心期时，用含0、150 mmol/L、200 mmol/L、250 mmol/L、300 mmol/L 5个不同浓度的NaCl的1/2 Hoagland溶液对不同处理的植株分别浇灌，且每天按此浓度浇灌。为保持处理浓度一致，每天浇灌量为蛭石持水量的两倍。从开始盐处理起，每天观察然后记录幼苗的生长状况，以确定非转基因对照玉米苗的耐盐强度。

3.4.2转基因后代植株的盐胁迫处理
选取T₂代转基因株系玉米种子5份(编号: N48, N36, N12, N31, N32)，每个株系70粒种子，盆栽7盆，每盆10粒。种子发芽和播种方法同3.4.1。待幼苗(T₃代)长至3叶1心时，取样提取DNA进行PCR检测，保留PCR阳性植株做进一步试验。每个株系从保留植株中任选18株，以1份(18株)非转基因玉米植株为对照，每个处理6株，三次重复。分别用3.4.1中筛选出的NaCl适宜胁迫浓度的1/2 Hoagland营养液对植株进行盐胁迫处理。浇灌方法参照3.4.1。盐胁迫一周后，观察记录各处理植株的表观性状；测定SOD活性、POD活性、MDA含量和叶绿素含量4个与抗逆性相关的生理生化指标。

3.4.3生理生化指标测定方法
SOD活性的测定采用氮蓝四唑法(郝再彬等, 2004, 哈尔滨工业大学出版社, pp.102-103)；POD活性、MDA含量测定参照张志良和翟伟菁的方法(张志良和翟伟菁, 2007, 高等教育出版社, pp.123-124, 274-275)；叶绿素含量测定采用如下方法：将一定量叶片剪碎后放入试管中，加80%丙酮20 mL后封口，置暗处24 h，当叶片完全脱色变白后，以丙酮为参比液，分别测定663 nm和645 nm的OD值，计算叶绿素的含量。

3.4.4根据生理生化指标检测结果进行植株耐盐性评价的方法
参照齐冰洁(2001)、沈振荣(2006)等的方法，对测定结果进行显著性检验，其后对检验结果用数字赋值：a=1，b=2，c=3，以此类推，并计算每个材料赋值的平均值。最终根据转基因材料的平均值与对照的平均值的差值大小对转基因株系进行耐盐性分级。

3.4.5统计分析
试验数据采用Excel2003及SPSS软件进行分析，5%显著水平下用Duncan’s方法进行多重比较，检验各处理平均值之间的差异显著性。

作者贡献
任小燕是本研究的实验设计者和执行人，并完成数据统计，论文初稿的写作；杜建中参与试验结果分析及论文修改；孙毅是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作和修改，是本文的责任作者。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08003-017B, 2009ZX08003-005B)和山西省科技攻关项目(20110311009)资助。

参考文献
Frame B.R., Drayton P.R., Bagnali S.V., Lewnau G.J., Bullock W.P., Wilson H.M., Dunwell J.M., Thompson J.A., and Wang K., 1994, Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide whisker-mediated transformation, The Plant Journal, 6(6): 941-948

Frame B.R., Shou H., Chikwamba R.K., Zhang Z., Xiang C., Fonger T.M., Pegg S.E., Li B., Nettleton D.S., Pei D., and Wang K., 2002, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system, Plant Physiol., 129(1): 13-22

Du J.Z., Sun Y., Wang J.X., Hao Y.S., Wang Y.X., and Zhang L.J., 2011, Transgenic maize plants with rice NibT gene and their MDMV-resistance, Xibei Zhiwu Xuebao (Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica), 31(5): 893-901 (杜建中, 孙毅, 王景雪, 郝曜山, 王亦学, 张丽君, 2011, 转水稻NibT基因玉米植株的获得及抗病性研究, 西北植物学报, 31(5): 893-901)

Golovkein M.V., Ábraháma M., Móroczb S., Bottka S., Fehéra A., and Dudits D., 1993, Production of transgenic maize plants by direct DNA uptake into embryogenic protoplasts, Plant Sci., 90(1): 41-52

Kathleen D.H., Bonne E., Bossut M., De Beuckeleer M., and Leemans J., 1992, Transgenic maize plants by tissue electroporation, The Plant Cell, 4(12): 1495-1505

Mcneil S.D., Nuccio M.L., and Hanson A.D., 1999, Betaines and related osmoprotectants, Targets for metabolic engineering of stress resistance, Plant Physiol., 120(4): 945-949

Kishitani S., Takanami T., Suzuki M., Oikawa M., Yokoi S., Ishitani M., Alvarez-Nakase A.M., and Takabe T., 2000, Compatability of glycinebetaine in rice plants: evalutation using transgenic rice plants with a gene for peroxisomal betaine aldehyde dehydrogenase from barley, Plant Cell Eviron., 23(1): 107-114

Negrotto D., Jolley M., Beer S., Wenck A.R., and Hansen G., 2000, The use of phosphomanose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation, Plant Cell Rep., 19(8): 798-803

Nuccio M.L., Russell B.L., Nolte K.D., Rathinasabapathi B., Gage D.A., and Hanson A.D., 1998, The endogenous choline supply limits glycine betaine synthesis in transgenic tobacco exressing cho-line monooxygenase, Plant J., 16(4): 487-498

Petolino J.F., Hopkins N.L., Kosegi B.D., and Skokut M., 2000, Whisker-mediated transformation of embryogenic callus of maize, Plant Cell Rep., 19(8): 781-786

Qi B.J., Yi j., Gu A.L., and Yuan J.Z., 2001, Studies on the Salt Hardiness in Seeds and Seedling of Leymus Hochst, Ganhanqu Ziyuan Yu Huanjing (Journal of Arid Land Resources and Environment), 15(S): 41-46 (齐冰洁, 易津, 谷安琳, 袁金柱, 2001, 赖草属牧草种子及幼苗耐盐性生理基础的研究, 干旱区资源与环境, 15(S): 41-46)

Rhodes D., and Hanson A.D., 1993, Quaternary ammonium and tertiary sulfonium compounds in higher plants, Annu. Rev. Plant Physiol., 449(1): 357-384

Sun Y., Wang J.X., and Cui G.M., 2006, Supersonic wave pollen treating process to induce plant's gene transfer, China Patent, ZL99121152.9 (孙毅, 王景雪, 崔贵梅, 2006, 超声波处理花粉介导植物基因转化方法, 中国专利, ZL99121152.9)

Song J.D., Lin C.J., Wei Z.Y., Han J.Y., and Xing S.C., 2012, A practical approach using ultrasound-assisted transformation in maize, Yumi Kexue (Journal of Maize Sciences), 20(2): 48-51 (宋鉴达, 林春晶, 韦正乙, 韩俊友, 邢少辰, 2012, 利用超声波处理花粉转化法获得玉米转基因新材料, 玉米科学, 20(2): 48-51)

Shen Z.R., YangW.R., and Xu X.R., 2006, Effect of salt stress on germination of Alfalfa seeds fengmei, Zhongzi (Seed), 25(4): 34-37 (沈振荣, 杨万仁, 徐秀梅, 2006, 不同盐分胁迫对苜蓿种子萌发的影响, 种子, 25(4): 34-37)

Shan C.J., Liu X., Liu S.Y., Yu S.L., Zhang L., Wang Z.H., and Di H., 2012, Identification of salt-tolerance of transgenic maize with BcWRKY1 gene, Yumi Kexue (Journal of Maize Sciences), 20(2): 27-32 (单长建, 刘学, 刘思言, 于少龙, 张林, 王振华, 邸宏, 2012, 转BcWRKY1转录因子基因玉米耐盐性鉴定方法的建立及高耐盐株系的筛选, 玉米科学, 20(2): 27-32)

Shen Y.G., She B.X., Zhang J.S., and Chen S.Y., 2001, Cloning and characterization of CMO gene from Atriplex hortensis, Shengwu Gongcheng Xuebao (Chinese Journal of Biotechnology), l7(1): 1-6 (沈义国, 杜保兴, 张劲松, 陈受宜, 2001, 山菠菜胆碱单氧化物酶基因(CMO)的克隆与分析, 生物工程学报, l7(1): 1-6)

Gordon-Kamm W.J., Spencer T.M., Mangano M.L., Adams T.R., Daines R.J., Start W.G., O'Brien J.V., Chambers S.A., Adams W.R.J., Willetts N.G., Rice T.B., Mackey C.J., Krueger R.W., Kausch A.P., and Lemaux P.G., 1990, Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants, Plant Cell, 2(7): 603-618

Wan Y.C., Widholm J.M., and Lemaux P.G., 1995, Type-I callus as a bombardment target for generating fertile transgenic maize (Zea mays L.), Planta, 196(1): 7-14

Wei Y.J., Zhang J.W., and He Q.W., 2010, Study on the influence factors about transferring radish peptide gene to wild opium poppy using pollen-mediated, Zhongguo Nongxue Tongbao (Chinese Agricultural Science Bulletin), 26(15): 32-37 (魏玉杰, 张金文, 何庆祥, 2010, 花粉介导法将萝卜抗菌肽基因导入野罂粟的影响因素研究, 中国农学通报, 26(15): 32-37)

Wang J.X., Sun Y., Cui G.M., and Hu J.J., 2001, Transgenic maize plants obtained by pollen-mediated transformation, Zhiwu Xuebao (Acta Botanica Sinica), 43(3): 275-279 (王景雪, 孙毅, 崔桂梅, 胡晶晶, 2001, 花粉介导法获得玉米转基因植株, 植物学报, 43(3): 275-279)

Wang S.C., Wang G.Y., Ding Q.X., Zhang H., Xie Y.J., and Dai J.R., 1999, Studies of transgene segregation and integration in maize, Yichuan Xuebao (Acta Genetica Sinica), 26(3): 254-261 (王守才, 王国英, 丁群星, 张宏, 谢友菊, 戴景瑞, 1999, 转基因在玉米中的遗传分离与整合特性的研究, 遗传学报, 26(3): 254-261)

Yamaguchi T, and Blumwald E, 2005, Developing salt-tolerant crop plants: challenges and opportunities, Trends Plant Sci., 10(12): 615-620

Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari T., and Kumashiro T., 1996, High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens, Nat. Biotechnol., 14(6): 745-750

Zeng C.L., and Chen C.Y., 2010, Physiological effect of exogenous salicylic acid on decreasing salt damage to pepper seedlings , Dongbei Nongye Daxue Xuebao (Journal of Northeast Agricultural University), 41(11): 32-36 (曾长立, 陈禅友, 2010, 外源水杨酸降低辣椒幼苗盐害的生理效应, 东北农业大学学报, 41(11): 32-36)

Zhao Z.Y., Gu W.N., Cai T.S., Tagliani L., Hondred D., Bond D., Schroeder S., Rudert M., and Pierce D., 2001, High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize, Mol. Breeding, 8(4): 323-333